ВЗАИМОСВЯЗЬ ПОКАЗАТЕЛЕЙ НЕЗАВИСИМЫХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОФЛАВОНОИДОВ

чт, 18/06/2020 - 15:28

Сведения об авторах

Сапиева Ардак Оналбековна, кандидат химических наук, доцент кафедры общей и биологической химии

НАО «Медицинский Университет Астана»

(010000, Республика Казахстан, г.Нур-Султан, улица Бейбитшилик, 49а, e-mail: ardaksapieva73@mail.ru);

Казбекова Айнагуль Талгатовна, кандидат медицинских наук, начальник отдела мониторинга клинической деятельности и взаимодействия с клиническими базами

НАО «Медицинский Университет Астана»

(010000, Республика Казахстан, г.Нур-Султан, улица Бейбитшилик, 49а, e-mail: kazbekova_mua@mail.ru);

Мадиева Шарапат Абдиганиевна, магистр агрохимии и почвоведения, старший преподаватель кафедры общей и биологической химии

НАО «Медицинский Университет Астана»

(010000, Республика Казахстан, г.Нур-Султан, улица Бейбитшилик, 49а, e-mail: sharapat.828486@gmail.com);

Кенжешова Акниет Казбековна, студентка 3 курса специальности Фармация

НАО «Медицинский Университет Астана»

(010000, Республика Казахстан, г.Нур-султан, улица Бейбитшилик, 49а, e-mail: vousmevoyez.2000@mail.ru);

Байсаров Габиден Маратович, магистр технических наук, заведующий лабораторией химии природных соединений

АО «Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия»

(100009, Республика Казахстан, г.Караганда, улица М.Газалиева,4, e-mail: info@phyto.kz);

Сейтембетов Талгат Султанович, заведующий кафедрой общей и биологической химии

НАО «Медицинский Университет Астана»

(010000, Республика Казахстан, г.Нур-Султан, улица Бейбитшилик, 49а, e-mail: stalgat49@mail.ru);

Адекенов Сергазы Мынжасарович, доктор химических наук, профессор, председатель правления АО «Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия»

(100009, Республика Казахстан, г.Караганда, улица М.Газалиева,4, e-mail: info@phyto.kz).

Актуальность

В процессе изучения биологической активности определяющим фактором является достоверность и независимость оценки эффекта потенциального препарата. В связи с чем необходимо комплексное исследование изучаемого объекта современными и независимыми методами invitro, что предопределяет возможность изучения и соответствующего проявления данного биологического свойства invivo.

Введение

Казахстан располагает уникальными запасами растений дикорастущих видов, обладающих лекарственными свойствами, значительная часть которых перспективна для исследований их химического состава и биологической активности. Лекарственные растения являются сырьем для получения фитопрепаратов с разнообразным спектром фармакологического и терапевтического действия, которые, как правило, не сопровождаются нежелательными побочными эффектами.

В настоящее время многие антиоксидантные и гепатопротекторные препараты, применяемые в клинической практике, являются синтетическими, вызывают аллергические реакции.Это обстоятельство обуславливает актуальность в фармакотерапии и профилактике заболеваний "свободнорадикальной патологии" и соответствующее применение средств растительного происхождения, действие которых вызвано синергизмом действия таких природных соединений как полифенолы, аминофенолокислоты, высшие жирные кислоты и другие. В связи с вышеуказанными аспектами актуальна проблема разработки и внедрения в производство фитопрепаратов и промышленного использования растительного сырья [1,2]. Эффективная терапия хронических заболеваний печени, а также профилактика лекарственных гепатопатий являются одними из актуальных проблем современной медицины. В патогенезе поражений печени большое значение отводится окислительному стрессу. Одним из факторов, модифицирующих фосфолипидный состав биологических мембран, является развитие в них процессов свободно-радикального окисления ненасыщенных жирных кислот. Флавоноиды обладают способностью нейтрализовать активные формы кислорода и обрывать цепные реакции, поэтому широкий спектр биологической активности и их малая токсичность, отсутствие аллергизирующих и кумулятивных свойств позволяет рассматривать биофлавоноиды как перспективный источник для практического использования в медицине [3,4].

Цель

Изучить антиоксидантную и антирадикальную активность природных флавоноидов и их функциональных производных независимыми спектрофотометрическими методами.

Материалы и методы исследования

Метод определения железо-восстанавливающего потенциала – FRAP (FerricReducingAntioxidantPower) исследуемых соединений. К 0,1 мл спиртового раствора исследуемого образца в диапазоне концентраций 0,25; 0,5; 0,75 и 1,0 мг/мл добавляется 0,25 мл фосфатного буфера (0,2 М, рН 6,6) и 0,25 мл 1% раствора гексацианоферрата (III) калия. Реакционная смесь инкубируется в течение 20 минут при 50ºС, реакция останавливается добавлением 0,25 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Верхний слой полученного раствора объемом 0,5 мл смешивается с 0,5 мл дистиллированной воды и 0,1 мл 0,1% FeCl₃. Измерение оптической плотности производится при 700 нм на спектрофотометре AgilentCary 60. Для оценки антиоксидантной активности (АОА) применяют аскорбиновую и галловую кислоты.

Определение антирадикальной активности (АРА) ингибированием DPPH (1,1-дифенил-2-пикрилгидразил) радикала анализируемыми веществами.0,1 мл аликвоты исследуемого образца в диапазоне концентраций 0,01-1 мг/мл, добавляли к 3 мл 6×10^-5М этанольного раствора радикала DPPH. После интенсивного перемешивания растворы оставляли в темноте на 30 минут. Измерение оптической плотности выполнено на спектрофлуориметре AgilentCary 60 при 520 нм, стандартом являлся бутилгидроксианизол [5].

Применение метода инициированной хемилюминесценции (ХЛ) для определения антиоксидантной и антирадикальной активности. Интенсивность и динамику хемилюминесценции регистрировали на спектрофлуориметре CaryEclipce («AgilentTechnologies») при420 нм. Метод основан на свободнорадикальном окислении люминола перекисью водорода (рН 7,4) в результате которого происходит эмиссия света, которая убывает в присутствии потенциального антиоксиданта [6,7].

Результаты

В научной литературе отмечается широкий спектр биологической активности флавоноидов растительного происхождения. В последние годы получило определенное развитие изучение возможности применения метода FRAP как для оценки антиоксидантной активности invitro экзогенных объектов, так и для определения суммарного содержания антиоксидантов. Перед нами стояла задача выполнить исследования по изучению взаимосвязи между содержанием веществ с установленными химическими структурами и их антиоксидантной активностью, что является актуальной проблемой. Так, решение данного вопроса открывает возможность выполнения направленного синтеза новых соединений с потенциальной биологической активностью путем химической модификации природных соединений. По методу определения железо-восстанавливающего потенциала – FRAP полученные результаты приведены в Таблице 1.

Для оценки антирадикальной активности указанных объектов нами применен метод ингибирования 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил радикала анализируемыми веществами. Установлено, что антирадикальная активность исследуемого объекта проявляется в уменьшении величины оптической плотности раствора DPPH, обусловленного переходом радикала DPPH в нерадикальную форму в результате антирадикального эффекта исследуемого индивидуального вещества. Количественной характеристикой антирадикального свойства в данной методике является величина антирадикальной активности, поэтому для объяснения механизма установленного действия конкретного объекта целесообразно знание химической структуры органического соединения.

Объектами для исследования антирадикальной активности явились соединения дигидрокверцетин (ДКВ); 2-(3,4-диметоксифенил)-5-гидрокси-3,6,7-триметокси-4Н-хромен-4-он (Af-1); 5-гидрокси, 7-метокси-2-фенил–4Н-хромен-4-он (Pb-3) и (R,E)-7-метокси-4-(пропан-2-илиденгидразоно)-2-фенилхроман-5-ол(Г₃Pb). Установлено, что для контрольного раствора, содержащего 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилрадикал, величина оптической плотности составляет 1,1457±0,0010. Ранее было определено наличие зависимости между динамикой активности изучаемого объекта и значением оптической плотности раствора. Данная зависимость видна на примере ВНА и флавоноидов. Динамика оптической плотности и концентрации раствора соединения отражена в Таблице 2 и изменение антирадикальной активности флавоноидов АРА (%) на Рисунке 1.

В наших опытах повторные измерения одинаковых рабочих растворов показывали практически аналогичные кривые индуцированной хемилюминесценции.

Обсуждение

В аспекте изучения корреляции между данными разных способов оценки биоактивности актуален вопрос взаимосвязи между данными разных показателей. Например, для антиоксидантной активности нами выполнено сравнение между соединениями показателей оптической плотности, концентрации и величинами антиоксидантного эффекта (%) вещества. Установлено, что между указанными показателями имеет место определенная корреляция: рост антиоксидантной активности при увеличении концентрации и рост антиоксидантной активности при повышении оптической плотности раствора. Полученные результаты указывают на наличие единого механизм ингибирования перекисных процессов в присутствии экзогенных флавоноидов. В настоящей работе выполнена оценка антиоксидантной активности флавоноидов дигидрокверцетина (ДКВ); 2-(3,4-диметоксифенил)-5-гидрокси-3,6,7-триметокси-4Н-хромен-4-она (Af-1); 5-гидрокси, 7-метокси-2-фенил–4Н-хромен-4-она(Pb-3) и (R,E)-7-метокси-4-(пропан-2-илиденгидразоно)-2-фенилхроман-5-ола(Г₃Pb). Установлено антиоксидантное свойство флавоноида пиностробина и оксимапиностробина, которое сравнивали с аналогичным эффектом ионола, бутилгидроксианизола и других антиоксидантов. Показателем антиоксидантной активности исследуемых объектов является величина оптической плотности, в частности, у АК наибольшее значение оптической плотности, а у соединений Af-1, Pb-3 и Г₃Pb антиоксидантный эффект менее выражен.

Флавоноиды дигидрокверцетин (ДКВ) и оксимпиностробина на примере люминолинициированной хемилюминесценции ингибировал свободнорадикальное окисление, и степень эффекта зависела от концентрации экзогенного вещества, что следует из формы кривой кинетики данной реакции (Рисунок 2) [8,9]. Анализ литературы по хемилюминесцентному анализу как индивидуальных органических соединений, выделенных из растений и последующей химической модификации, так и суммарных объектов (экстракты растений), указывает на перспективность данного метода и может найти применение в дальнейших исследованиях по разработке новых антиоксидантов и гепатопротекторов [10].

Заключение

FRAP–методом исследована invitro антиоксидантная активность флавоноидов и установлена данная активность для растворов дигидрокверцетина, пиностробина и его оксима, которая уступает эффекту аскорбиновой и галловой кислот, обладающих выраженным антиоксидантным действием. Анализ антирадикальной активности invitro методом определения способности ингибирования DPPH ряда соединений показал активность для образцов Af-1, Рb-3 и Г₃Pb, которая сопоставима со свойством бутилгидроксианизола. Данные хемилюминесцентного анализа указывают на наличие корреляции между антиоксидантной, антирадикальной активностью и показателями хемилюминесценции флавоноидов, что подтверждает возможность связи между данными свойствами исследованных соединений.

Вклад авторов

Концепция и дизайн: А.О. Сапиева, А.Т. Казбекова, Ш.А. Мадиева.

Сбор и обработка данных: А.К. Кенжешова, Ш.А. Мадиева.

Предоставление материалов исследования: Г.М. Байсаров, С.М. Адекенов.

Анализ и интерпретация данных: А.О. Сапиева, Т.С. Сейтембетов.

Подготовка рукописи: А.О. Сапиева, А.Т. Казбекова, Ш.А. Мадиева, А.К. Кенжешова.

Окончательное одобрение рукописи: А.О. Сапиева,Т.С. Сейтембетов.

Административная поддержка: А.О. Сапиева.

Список литературы

1.Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Какорин П.А. Антиоксидантная активность биологически активных веществ водных извлечений караганы гривастой (CaraganaJubata (Pall.) // Сборник научных трудов съезда биофизиков России, том 2, Краснодар, 2019, С. 262-263.

2. M.S. Stankovic, N. Niciforovic, M.Topuzovic et al. Total phenolic content, flavonoid concentrations and antioxidant activity, of the whole plant and plant parts extracts from Teucriummontanum L. var. montanum, f. supinum (L.) Reichenb // Biotechnol. &Biotechnol.Eq.-2011.-25.-P.2222-2227.

3.K. Paulpriya, M. Packia Lincy, P.S. Tresina, V.R. Mohan. In vitro Antioxidant Activity, Total Phenolic and Total Flavonoid Contents of Aerial Part Extracts of Daphnipfyllumneilgherrense (WT) Rosenth // J. Bio. Innov.-2015.-4(6).-P. 257-268.

4.Демин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Антиоксидантное действие дигидрокверцетина и рутина в пероксидазных реакциях, катализируемых цитохромом С // Вестн. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. 2008. Т.49. №5. С.354-359.

5. Казбекова А.Т., Сапиева А.О., Сейдахметова Р.Б., Кенжешова А.К., Сейтембетов Т.С., Адекенов С.М. Изучение антиоксидантной и антирадикальной активности экстрактов эндемичных растений Казахстана // Валеология. Денсаулық-Ауру-Сауықтыру. 2020. №1. С. 233-236.

6.A. Krasowska, D. Rosiak, K. Szkapiak, M. Lukaszewicz. Chemiluminescence Detection of Peroxyl Radicals and Comparison of Antioxidant Activity of Phenolic Compounds // Current Topics in Biophysics. - 2000.-24(2).-P. 89-95.

7.Stancho Stanchev, Ivanka Pencheva, Spiro Konstantinov, Danka Obreshkova, Vera Hadjimitova. Application of UV-Vis spectrophotometric and chemiluminescent methods for the evaluation of the antioxidant action of curcumin // J. Serb. Chem. Soc.-2012.-77(8).-P. 1063-1069.

8. Барсукова М.Е. Флуоресцентные индикаторные системы для определения флавоноидов и пероксидов в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях: дисс. … канд.хим.наук, М., 2019.

9. E. Plotnikov, E. Korotkova, O. Voronova, N. Sazhina, E. Petrova, A. Artamonov, L. Chernyavskaya, E. Dorozhko. Comparative investigation of antioxidantactivity of human serum blood by amperometric, voltammetric and chemiluminescent methods // Arch. Med. Sci.-2016.-5.-P.1072-1076.

10.Богданова Т.Б. Изучение антиоксидантной активности тонизирующего и гепатопротекторного фитосборов с применением хемилюминесцентного метода // Научный медицинский вестник. -2015.-№1(1).-С.40-44.

Источники финансирования

Исследование не имело спонсорской поддержки.

Вы здесь

ВЗАИМОСВЯЗЬ ПОКАЗАТЕЛЕЙ НЕЗАВИСИМЫХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОФЛАВОНОИДОВ